Die Fluoreszenzmikroskopie ist eine wichtige Methode zur Erforschung biologischer Strukturen. Durch intrinsische Eigenschaften der Fluorophore ist es möglich, deren Signale voneinander zu trennen und individuell zu lokalisieren. Hierdurch erhält man quantitative Positionsinformationen, was zu einer Verbesserung der strukturellen Auflösung führt und die Möglichkeit statistischer Analysen eröffnet. In dieser Arbeit wurde die Lokalisationsmikroskopie für spektral verschiedene Markierungen innerhalb biologischer Präparate angewandt. Es wurden verschiedene Algorithmen entwickelt, um den mechanischen und chromatischen Versatz der erhaltenen Positionsdaten zu korrigieren und diese weiter zu analysieren. Beispielsweise wurde die relative Verteilung zwischen einem DNA-Strukturprotein (H2A) zu einem am DNA-Umbau beteiligten Protein (SNF2h) untersucht. Gleichzeitig wurden diese Verteilungen mit zufälligen Verteilungen von Signalpositionen innerhalb der gleichen globalen Strukturen verglichen. Dadurch konnte gezeigt werden, dass sich die Verteilungen signifikant von zufälligen Verteilungen unterscheiden. Weiterhin ist es möglich, die Daten auf Signalanhäufungen zu überprüfen und deren Eigenschaften zu bestimmen. Dies wurde erst an simulierten Verteilungen getestet und später unter anderem zur Analyse von Signalanhäufungen von Centromerproteinen (CENP-A, CENP-B und CENP-C) im menschlichen Kinetochor genutzt. Zusätzlich kann die axiale Position der Lokalisationsdaten innerhalb der Struktur auf etwa 50nm genau bestimmt werden. F¨ur die Verteilung der Fluorophore in Tabakmosaikviren wurde ein Modell entwickelt, welches an die experimentellen Daten angepasst wurde. Durch die Lokalisationsmikroskopie konnte die elektronenmikroskopisch bestimmte Breite dieser Struktur von 18nm bestätigt werden. Die Positionsgenauigkeit der einzelnen Signalpositionen betrug in diesem Fall im Mittel 8nm. Um das von der Probe emittierte Fluoreszenzsignal aufgrund verschiedener Eigenschaften, wie beispielsweise unterschiedliche Polarisationsrichtungen oder verschiedene Spektralbereiche, aufzuspalten und simultan auf einem einzigen Detektor abzubilden wurde ein neuer Mikroskopaufbau realisiert. Hierdurch kann die Aufnahme einer Zweifarbenmessung beschleunigt werden, da beide Farbkanäle gleichzeitig detektiert werden. Ein weiterer Vorteil ist, dass kein mechanischer Versatz zwischen beiden Messungen entsteht. |