Wissenswertes zur Fluoreszenz in situ Hybridisierung


Chemisch gesehen ist die DNA ein linearer Polyester aus Desoxyribose und Phosphorsäure mit heterozyklischen Stickstoffbasen in der Seitenkette. Zwei solche DNA-Einzelstränge können durch Wasserstoffbrückenbindungen eine Doppelhelix ausbilden. Verglichen mit einer kovalenten Elektronenpaarbindung sind diese Wasserstoffbrücken schwache Bindungen, so daß durch Erwärmung auf Temperaturen um 80°C oder durch Zugabe organischer Lösungsmittel wie Formamid die Doppelhelix in zwei Einzelstränge getrennt werden kann. Diesen Vorgang nennt man Denaturierung. Die Temperatur, bei der diese Separation des Doppelstranges stattfindet, wird als Schmelztemperatur bezeichnet.

Zwei DNA Einzelstränge können nach einer Denaturierung wieder spezifisch zum Doppelstrang rekombinieren, wenn die Basensequenz der Einzelstränge zueinander komplementär ist. Diese spezifische Rekombination von DNA-Einzelsträngen verschiedener Herkunft zum Doppelstrang nennt man Hybridisierung. Eine Hybridisierungsstelle kann dadurch nachgewiesen werden, daß man an ein DNA-Molekül einen Fluoreszenzfarbstoff anbindet (siehe Schaubild) und diesen nach erfolgter Hybridisierung durch eine geeignete Lichtquelle zur Fluoreszenz anregt. Setzt man als Ziel-DNA ein biologisches Präparat ein, so kann man durch diese spezifische Rekombination eine ganz bestimmte DNA-Sequenz z.B. in einem Chromosom oder in einem Zellkern nachweisen. Diese spezielle Hybridisierungvariante wird Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) genannt.

In der molekularen Genetik stellt die Fluoreszenz in situ Hybridisierung ein wichtiges Markierungsverfahren dar, das für viele Untersuchungen benutzt wird. So kann man mit Hilfe der Fluoreszenz in situ Hybridisierung die Anzahl, Lage und Aktivität von Genen studieren oder auch gesamte Chromosomen mittels chromosomaler in situ Suppressions [CISS-] Hybridisierung [Cremer T. 1988; Lichter 1988 ] markieren. Die Standardprotokolle zur Fluoreszenz in situ Hybridisierung sehen einen Formamidgehalt von 40-60% vor, um die Denaturierungstemperatur zu senken und um die Hybridisierungsbedingungen zwischen den verschiedenen Basen zu nivellieren.

Die Zugabe von Formamid ist aber nicht unbedingt nötig, da die chromosomale DNA auch durch reines Erhitzen denaturiert und anschließend in wäßriger Lösung hybridisiert werden kann [Celeda 1992]. Diese formamidfreie Hybridisierung hat den großen Vorteil, daß Sonden- und Ziel-DNA viel schneller rekombinieren können.

Die Hybridisierungszeit verkürzt sich dadurch von 12-14 Stunden auf ein bis zwei Stunden [Haar 1994]. Aufgrund dieser Verkürzung der Hybridisierungszeit wird diese Hybridisierungsvariante Fast-FISH genannt. Ein weiterer Vorteil formamidfreier Hybridisierungen liegt in der Möglichkeit, während der Rekombination die Temperatur zu erhöhen, was sowohl die Geschwindigkeit als auch die Spezifität der Rekombination erhöht [Durm 1996 ]. (Bei Anwesenheit von Formamid, ist eine solche Temperaturerhöhung während der Hybridisierung nur sehr eingeschränkt möglich, da dieses organische Lösungsmittel einen starken destabilisierenden Einfluß auf die Doppelstränge hat und oberhalb einer Temperatur von 50 °C keine Rekombination mehr stattfinden kann [Marmur 1961] ).

Mittlerweile ist es durch diese Fast-FISH Technik gelungen, in nur zwei Stunden ein Chromosom spezifisch zu markieren. Allerdings müssen hierfür spezielle DNA-Proben verwendet werden.

Darüber hinaus ist es jetzt auch möglich, in verschiedenen Farben in kurzer Zeit zu hybridisieren. Eine Anzahl von Fast-Multicolor Bildern haben wir für Sie zusammengestellt.

Publikationen zu FISH-Anwendungen in der lichtoptischen Analyse von Genomstrukturen

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